Cómo la reacción en cadena de la polimerasa amplifica los genes

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica genética molecular para hacer copias múltiples de un gen y también es parte del proceso de secuenciación del gen.

¿Cómo funciona la reacción en cadena de la polimerasa?

Las copias de genes se hacen con una muestra de ADN, y la tecnología es lo suficientemente buena para hacer copias múltiples de una sola copia del gen que se encuentra en la muestra. La amplificación por PCR de un gen para hacer millones de copias, permite la detección e identificación de secuencias génicas usando técnicas visuales basadas en el tamaño y la carga (+ o -) del fragmento de ADN.

Bajo condiciones controladas, pequeños segmentos de ADN son generados por enzimas conocidas como ADN polimerasas, que añaden desoxinucleótidos complementarios (dNTP) a un fragmento de ADN conocido como "plantilla". Incluso pedazos más pequeños de ADN, llamados "cebadores" se usan como punto de partida para la polimerasa. Los cebadores son pequeñas piezas de ADN hechas por el hombre (oligómeros), generalmente entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. Se hacen conociendo o adivinando secuencias cortas de ADN en los mismos extremos del gen que se amplifica. Durante la PCR, el ADN que se está secuenciando se calienta y las dobles hebras se separan. Al enfriarse, los cebadores se unen a la plantilla (llamada recocido) y crean un lugar para que comience la polimerasa.

La técnica PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue posible gracias al descubrimiento de termófilos y enzimas polimerasas termófilas (enzimas que mantienen la integridad estructural y la funcionalidad después del calentamiento a altas temperaturas).

Los pasos involucrados en la técnica de PCR son los siguientes:

• Se crea una mezcla, con concentraciones optimizadas de la plantilla de ADN, enzima polimerasa, cebadores y dNTP. La capacidad de calentar la mezcla sin desnaturalizar la enzima permite la desnaturalización de la doble hélice de la muestra de ADN a temperaturas en el rango de 94 grados Celsius.

• Después de la desnaturalización, la muestra se enfría a un rango más moderado, alrededor de 54 grados, lo que facilita el recocido (unión) de los cebadores a las plantillas de ADN monocatenario.
• En el tercer paso del ciclo, la muestra se vuelve a calentar a 72 grados, la temperatura ideal para la ADN polimerasa Taq, para la elongación. Durante la elongación, la ADN polimerasa usa la única cadena de ADN original como plantilla para añadir dNTP complementarios a los extremos 3 'de cada cebador y generar una sección de ADN bicatenario en la región del gen de interés.
• Los cebadores que se hibridan con secuencias de ADN que no son una coincidencia exacta no permanecen recocidos a 72 grados, lo que limita el alargamiento al gen de interés.

Este proceso de desnaturalización, apareamiento y alargamiento se repite varias veces (30-40) veces, aumentando así exponencialmente el número de copias del gen deseado en la mezcla.Aunque este proceso sería bastante tedioso si se realiza manualmente, las muestras se pueden preparar e incubar en un termociclador programable, que ahora es común en la mayoría de los laboratorios moleculares, y se puede realizar una reacción de PCR completa en 3-4 horas.

Cada etapa de desnaturalización detiene el proceso de elongación del ciclo anterior, truncando así la nueva cadena de ADN y manteniéndola aproximadamente en el tamaño del gen deseado.

La duración del ciclo de elongación se puede alargar o acortar según el tamaño del gen de interés, pero eventualmente, a través de ciclos repetidos de PCR, la mayoría de las plantillas se restringirán al tamaño del gen de interés solo , ya que se habrán generado a partir de productos de ambos iniciadores.

Existen varios factores diferentes para la PCR exitosa que se pueden manipular para mejorar los resultados. El método más ampliamente utilizado para evaluar la presencia del producto de PCR es la electroforesis en gel de agarosa. Que se utiliza para separar los fragmentos de ADN en función del tamaño y la carga. Los fragmentos se visualizan usando colorantes o radioisótopos.

The Evolution

Desde el descubrimiento de la PCR, se han descubierto ADN polimerasas distintas del Taq original. Algunos de estos tienen una mejor capacidad de "corrección" o son más estables a temperaturas más altas, lo que mejora la especificidad de la PCR y reduce los errores de la inserción del dNTP incorrecto.

Algunas variaciones de la PCR se han diseñado para aplicaciones específicas y ahora se usan regularmente en laboratorios de genética molecular. Algunos de estos son PCR en tiempo real y PCR de transcriptasa inversa. El descubrimiento de la PCR también ha llevado al desarrollo de la secuenciación del ADN, la toma de huellas digitales del ADN y otras técnicas moleculares.