Para la secuenciación del ADN

El campo de la biotecnología es uno de cambio constante. El rápido crecimiento y desarrollo de la investigación de vanguardia dependen de la innovación y la creatividad de los científicos y su capacidad para ver el potencial en una técnica molecular básica y aplicarla a nuevos procesos. El advenimiento de la PCR abrió muchas puertas en la investigación genética, que incluye un medio de análisis de ADN e identificación de diferentes genes en función de sus secuencias de ADN.

La secuenciación del ADN también depende de nuestra capacidad para utilizar la electroforesis en gel para separar hebras de ADN que difieren en tamaño en tan poco como un par de bases.

Secuenciación de ADN

A finales de la década de 1970, se inventaron dos técnicas de secuenciación de ADN para moléculas de ADN más largas. Estos fueron el método Sanger (o dideoxy) y el método Maxam-Gilbert (división química). El método de Maxam-Gilbert se basa en la escisión específica de nucleótidos por sustancias químicas y se utiliza mejor para secuenciar oligonucleótidos (polímeros de nucleótidos cortos, generalmente menores de 50 pares de bases de longitud). El método de Sanger se usa más comúnmente porque se ha demostrado que es técnicamente más fácil de aplicar y, con el advenimiento de la PCR y la automatización de la técnica, se aplica fácilmente a largas cadenas de ADN, incluidos algunos genes completos. Esta técnica se basa en la terminación de la cadena mediante didesoxinucleótidos durante las reacciones de elongación de PCR.

Método de Sanger

En el método de Sanger, la cadena de ADN a analizar se usa como molde y la ADN polimerasa se usa, en una reacción de PCR, para generar cadenas complementarias usando cebadores.

Se preparan cuatro mezclas de reacción de PCR diferentes, conteniendo cada una un cierto porcentaje de análogos de didesoxinucleósido trifosfato (ddNTP) a uno de los cuatro nucleótidos (ATP, CTP, GTP o TTP). La síntesis de la nueva cadena de ADN continúa hasta que se incorpora uno de estos análogos, en cuyo momento la cadena se trunca prematuramente.

Cada reacción de PCR terminará conteniendo una mezcla de diferentes longitudes de cadenas de ADN, todas terminando con el nucleótido marcado didesoxi para esa reacción. La electroforesis en gel se usa luego para separar las hebras de las cuatro reacciones, en cuatro carriles separados, y determinar la secuencia de la plantilla original en función de qué longitudes de filamentos termina con qué nucleótido.

En la reacción automatizada de Sanger, se utilizan cebadores que están etiquetados con cuatro etiquetas fluorescentes de diferentes colores. Las reacciones de PCR, en presencia de los diferentes didesoxinucleótidos, se realizan como se describió anteriormente. Sin embargo, a continuación, las cuatro mezclas de reacción se combinan y se aplican a una única línea de un gel. El color de cada fragmento se detecta usando un rayo láser y la información se recoge mediante una computadora que genera cromatogramas que muestran picos para cada color, a partir de los cuales se puede determinar la secuencia de ADN de plantilla.

Por lo general, el método de secuencia automática solo es preciso para secuencias de hasta un máximo de aproximadamente 700-800 pares de bases de longitud. Sin embargo, es posible obtener secuencias completas de genes más grandes y, de hecho, genomas completos, usando métodos paso a paso como Primer Walking y Shotgun Secuenciación.

En Primer Walking , una porción viable de un gen más grande se secuencia con el método de Sanger. Se generan nuevos cebadores a partir de un segmento confiable de la secuencia y se usan para continuar la secuenciación de la porción del gen que estaba fuera del alcance de las reacciones originales.

La secuencia de escopeta implica el corte aleatorio del segmento de interés de ADN en fragmentos de tamaño más apropiado (manejable), la secuenciación de cada fragmento y la disposición de las piezas en función de las secuencias superpuestas. Esta técnica se ha facilitado mediante la aplicación de software para organizar las piezas superpuestas.